Руководящие принципы ВОЗ по взятию образцов у животных для лабораторной диагностики инфекции гриппа

12 января 2005 г.

Общая информация

Успешное проведение диагностики вирусных инфекций, в значительной степени, зависит от качества образцов и условий, в которых они перевозились и хранились до проведения их исследований в лаборатории. Образцы для выделения респираторных вирусов в клеточных культурах или куриных яйцах с развивающимися эмбрионами и для прямого выявления вирусных антигенов или нуклеиновых кислот, как правило, следует брать в течение первых трех дней после появления клинических симптомов гриппа. У млекопитающих, включая людей, свиней и лошадей, грипп представляет собой, главным образом, инфекцию дыхательных путей, в то время как у птиц он может проявляться в виде инфекции как дыхательных путей, так и кишечника.

Типы образцов

Для диагностики вирусных инфекций верхних дыхательных путей подходят различные образцы, взятые у млекопитающих и птиц:

• назальный мазок
• мазок из зева
• мазок из трахеи

В дополнение к мазкам из верхних дыхательных путей, взятие образцов у птиц для диагностики гриппа должно включать:

• мазок из клоаки
• образец фекалий

По возможности мазки из клоаки необходимо брать у живых или только что забитых птиц. Часто образцы фекалий можно взять только из клеток или окружающей среды, что исключает полную уверенность в их принадлежности конкретным особям.

Если в ходе расследования обнаружены мертвые животные, необходимо предположить наличие высоко патогенного птичьего гриппа и, помимо образцов из дыхательных путей и кишечника, взять репрезентативные образцы внутренних органов, включая мозг, селезенку, сердце, легкие, поджелудочную железу, печень и почки.

Образцы для лабораторной диагностики инфекции гриппа необходимо брать в порядке следующей очередности:

• У живых животных
• Из трахеи
• Из зоба/носа
• Из клоаки
• Фекалии (из окружающей среды)
• Питьевую воду
• У мертвых животных
• Легочные смывы
• Смешанную ткань (в том числе трахеи и легких)
• Фекалии (из окружающей среды)
• Из клоаки
• Питьевую воду

Процедуры взятия образцов

Необходимый материал

• 1-3 мл пластмассовые пробирки с завинчивающимися крышками
• Полиэфирные зонды с волоконными наконечниками (зонды-тампоны)
• Транспортная среда для вирусов
• Инструменты для аутопсии

Транспортная среда для вирусов

(А) Транспортная среда 199

1. Среда для тканевых культур 199, содержащая 0,5 % раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА)

2. В 1 литр 0,5 % раствора БСА добавить:
- бензилпенициллин (2 x 10⁶ IU/литр)
- стрептомицин (200 мг/литр)
- полимиксин B (2 x 10⁶ IU/литр)
- гентамицин (250 мг/litre)
- нистатин (0.5 x 10⁶ IU/litre)
- офлоксацин гидрохлорид (60 мг/литр), and
- сульфаметоксазол (0.2 г/литр)

3. Провести стерилизующую фильтрацию и разлить в 1,0-2,0 мл пробирки с завинчивающимися крышками.

Примечание: При растущем применении антибиотиков в животноводстве стало необходимым использование высоких концентраций противобактериальных и противогрибковых средств.

- ИЛИ -

(Б) Глицериновая транспортная среда

1. Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS):

2. Стерилизовать ЗФФР в автоклаве и соединить в соотношении 1:1 со стерильным глицерином до получения 1 литра

3. К 1 литру ЗФФР/глицерина добавить:

- бензилпенициллин (2 x 10⁶IU/литр)
- стрептомицин (200 мг/литр)
- полимиксин B (2 x 10⁶ IU/литр)
- гентамицин (250 мг/литр)
- нистатин (0.5 x 10⁶ IU/литр)
- офлоксацин гидрохлорид(60 мг/литр) и
- сульфаметоксазол (0.2 г/литр).

Для правильного выбора среды см. ниже раздел "Подготовка к взятию образцов".

Подготовка пробирок для взятия образцов

В стерильные пластмассовые пробирки с завинчивающимися крышками разлить по 1,0-2,0 мл транспортной среды. Предпочтительно хранить пробирки до их использования при температуре - 20°С. Однако в течение 48-96 часов (оптимальный период - менее 48 часов) их можно хранить при 4°С, а в течение более короткого периода времени (1-2 дня) - при комнатной температуре.

Подготовка к взятию образцов

Пробирки должны быть пронумерованы в соответствии с номерами, указанными в Форме для сбора данных в полевых условиях. По возможности, в Форме для сбора данных в полевых условиях необходимо указывать следующую информацию: тип животного, вид животного, тип образца, дату и место взятия образца и др.

Среда для тканевых культур (А) широко применяется для взятия и транспортировки клинических образцов у всех видов животных. Среда на основе глицерина (Б) обеспечивает более длительную устойчивость образцов в условиях, когда их незамедлительное охлаждение невозможно; она подходит для инокуляции яиц, но не подходит для инокуляции тканевых культур.

Клинические образцы необходимо брать указанными ниже способами и помещать в транспортную среду. Все образцы следует хранить в емкостях со льдом или при температуре 4°С.

Всегда следует соблюдать стандартные меры предосторожности, а при взятии образцов у пациентов необходимо применять барьерные методы защиты.

Назальный мазок

Сухой полиэфирный зонд-тампон ввести на несколько секунд в ноздрю параллельно нёбу. Затем вращательными движениями медленно вынуть зонд, прижимая его к нижней внутренней поверхности носа. Образцы из обеих ноздрей берутся одним и тем же зондом. Наконечник зонда ввести в пробирку, содержащую 2-3 мл транспортной среды, и отломить стержень аппликатора.

Мазок из зева

Энергично потереть заднюю стенку зева и поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Мазок из трахеи

Для взятия мазка из трахеи живых птиц ввести полиэфирный зонд-тампон в трахею и осторожно потереть им о стенки. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Мазки из трахеи мертвых животных, включая свиней на скотобойнях, можно брать после удаления легких и трахеи из туши. Надеть перчатки, взять трахею рукой, ввести зонд-тампон на максимальную длину и энергично потереть им о стенки трахеи. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Мазок из клоаки

Для взятия мазка из клоаки живой птицы ввести зонд-тампон глубоко в отверстие клоаки и энергично потереть им о стенки. Зонд-тампон должен быть сильно испачкан фекалиями. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Образцы фекалий

Образцы фекалий из клеток живых домашних птиц на птичьих рынках или образцы фекалий диких птиц из окружающей среды необходимо собирать из свежего влажного помета; зонд-тампон должен быть сильно испачкан фекалиями. Затем поместить мазок в транспортную среду, как указано выше.

Взятие сывороток для диагностики гриппа и эпиднадзора за ним

Образцы тканей

Образцы тканей, в идеале, необходимо немедленно замораживать без транспортной среды, а позднее измельчать и помещать в транспортную среду перед инокуляцией яиц или тканевых культур.

Для диагностики образец сыворотки острой фазы (3-5 мл цельной крови) необходимо брать вскоре после появления клинических симптомов и не позднее 7 дней после их появления. Образец сыворотки фазы выздоровления необходимо брать через 2-4 недели. Для серологических исследований животных на скотобойнях или свободно летающих диких птиц, выпускаемых на волю после взятия крови, берется один образец сыворотки. Свернувшуюся кровь центрифугировать при 2500 оборотах в минуту в течение 15 минут для отделения красных кровяных клеток от сыворотки. Сыворотку отпипетировать, а красные кровяные клетки можно утилизировать. Образцы сыворотки хранить при температуре -20°С.

Торговые наименования и коммерческие источники использованы только в целях идентификации и не означают их одобрения ВОЗ.